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背景[1-3]
膜蛋白提取试剂盒中含有蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和EDTA等，后续不适合用于蛋白酶、磷酸酯酶等受这些抑制剂影响的酶的活性测定，但抽提获得的膜蛋白或细胞浆蛋白适合用于检测蛋白的磷酸化水平。
试剂盒通过匀浆适度破碎细胞，经低速离心去除细胞核和少数未破碎的细胞产生的沉淀，随后取上清高速离心获得细胞膜沉淀和含有细胞浆蛋白的上清，然后通过优化的膜蛋白抽提试剂从沉淀中抽提获取膜蛋白。
约90分钟即可完成培养细胞或组织的细胞膜蛋白与细胞浆蛋白的分离和抽提。抽提得到的蛋白可以用于SDS-PAGE，Western、酶活性测定等后续实验。
膜蛋白提取试剂盒提供了一种比较简单、方便地从培养细胞或组织中抽提细胞膜蛋白和细胞浆蛋白的方法。抽提的膜蛋白不仅包括质膜上的膜蛋白，也包括线粒体膜、内质网膜和高尔基体膜等上的膜蛋白。
膜蛋白提取试剂盒
操作步骤
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1.对于悬浮培养或用细胞刮刮下的贴壁培养细胞，离心收集不少于1X细胞，再用预冷的双蒸水稀释至一倍浓度的洗涤液洗涤细胞三次，每次rpm（g）离心5min。
2.对于组织样本（mg）尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，冰上剪碎，再用预冷双蒸水稀释至一倍浓度的洗涤液洗涤细胞三次。
3.在上述细胞或组织样本中加入1mL提取Buffer（使用前，每mL提取Buffer中加入1μl蛋白酶抑制剂和1μlDTT），将组织在4°C环境下置于预冷的玻璃匀浆器中，手动匀浆30~50次，匀质匀浆至没有明显的组织小块。或将细胞超声破碎，每次30sec，3~4次，每次间隔1min，置于冰上冷却，超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于90％。
4.装入1.5mL的预冷的离心管中，冰上放置10min左右，期间取出剧烈振荡2~3次，于4°C，rpm（g）离心10min，弃沉淀，上清转至新管中。
5.上清置于37°C水浴10min。再室温，1rpm离心5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）。
6.取下层，加入μl冰冷灭菌水，4°C放置5min，再置于37°C水浴10min。
7.室温，1rpm（10g）离心5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）。
8.取下层，加入μl冰冷灭菌水，4°C放置5min，再置于37°C水浴10min。
9.室温，1rpm（10g）离心5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）。
10.最终得到的下层即为膜蛋白提取物，冷冻保存。
应用[4][5]
用于林麝源铜绿假单胞菌外膜蛋白的提取及免疫原性的研究
铜绿假单胞杆菌一直以来是困扰野生动物养殖的一大难题,属较难防控的细菌性疾病之一。该菌具有较强的耐药性,感染机体后,可产生多种毒力因子,其具有很强的致病作用,单独使用抗生素的治疗效果并不理想,这限制了抗生素的广泛使用。
根据林麝养殖场铜绿假单胞菌的分布情况,通过动物攻毒试验,成功筛选出了一株毒力最强的菌株作为试验菌株。经提取和纯化该菌株的外膜蛋白,并进行免疫接种,从细胞免疫、体液免疫和攻毒保护三个方面来评估该菌株的免疫原性,并对免疫效果进行评价,以期为林麝铜绿假单胞菌病的防控提供参考依据。
结果如下：1.试验菌株的筛选试验选取本实验室从林麝体内分离并保存的7株铜绿假单胞菌,并均用同一菌液浓度对试验小鼠进行攻毒,从中筛选出一株毒力最强的菌株（sp-19株）,最终,测得其对小鼠的LDso是6.×CFU。
2.外膜蛋白的纯化及鉴定通过试剂盒提取sp-19株的外膜蛋白。经SDS-PAGE电泳分析,显示该方法提取的外膜蛋白有8个蛋白条带,其分子量分别约为KD、71KD、52KD、43KD、36KD、22KD、18KD和9KD。免疫印迹结果显示,这些外膜蛋白均能与抗铜绿假单胞菌sp-19株阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。
3.外膜蛋白免疫效果评价分别将试剂盒提取的sp-19株纯化外膜蛋白、sp-19株全菌制备的免疫原和超声破碎提取的sp-19株外膜蛋白免疫实验小鼠。在四免后,采用间接ELISA的方法检测试验小鼠的抗体动态变化,结果显示,各抗原免疫组小鼠体内抗体滴度随免疫进程持续升高。其中,试剂盒提取的sp-19株纯化外膜蛋白抗原组小鼠的抗体水平最高,sp-19株全菌制备的免疫原组和超声破碎提取的sp-19株外膜蛋白抗原组次之,其效价分别达到1：12、1：2和1：。体外淋巴细胞增殖试验表明,sp-19株外膜蛋白能显著促进各抗原免疫组的小鼠T、B淋巴细胞的增殖,其增殖率分别为3.05、2.51和1.33：采用细胞因子检测试剂盒对免疫0、15、29、43和50天各抗原免疫组小鼠血液中的IL-4和IFN-y进行检测,其含量最高达pg/ml、87pg/ml.66pg/ml和pg/ml、pg/ml和97pg/ml。
4.外膜蛋白免疫保护性研究分别用试剂盒提取的sp-19株纯化外膜蛋白、sp-19株全菌制备的免疫原和超声破碎提取的sp-19株外膜蛋白免疫小鼠,二免后用5倍LDso的sp-19株活菌经腹腔攻毒,结果显示,试剂盒提取的sp-19株纯化外膜蛋白保护率为87.5%,sp-19株全菌制备的免疫原保护率为62.5%,超声破碎提取的sp-19株外膜蛋白保护率仅为12.5%,生理盐水对照组和佐剂对照全部死亡。被动免疫试验中,先分别将各抗原组免疫56天后的高免血清0.2ml腹腔注射于小鼠体内,2h后用2倍LDso的铜绿假单胞菌sp-19株活菌经腹腔攻毒。#试剂盒#
参考文献
[1]VaccinesforPseudomonasaeruginosa:alongandwindingroad[J].Priebe,Goldberg.ExpertReviewofVaccines.(4)
[2]ClinicalOut
