导言：饲逢禁抗1年多，聚焦“降本增效”，新形势下如何科学助力“无抗饲料”的研发？拒绝忽悠，拿数据说话！“绿养先踪第5季”活动收集、整理、发布行业内一线企业的相关动物试验研究成果，为助力行业高效应对挑战提供第一手可供参考的试验数据支持。
冷喷爱酸灵对ETEC感染小鼠肠道保护作用的研究
试验目的：
研究冷喷包被酸对ETEC攻毒小鼠机体免疫力、肠道屏障功能及微生态的影响
试验单位：
江西农业大学江西省动物营养重点实验室，江西省优质安全畜禽生产产教融合重点创新中心，广东酸能生物科技有限公司
试验产品：
爱酸灵：采用专利冷喷包被工艺，以苯甲酸为主要成分，复合乳酸等有机酸，苯甲酸含量高达40%以上。
试验设计：
试验共分为6个处理，每个处理6个重复，每个重复3只小鼠。处理一为对照组（CON），饲喂基础饲粮；处理二为攻毒组（ETEC），饲喂基础饲粮；处理三为纯苯甲酸粉组，在基础饲粮中添加2.0%的纯苯甲酸粉（含量≥99.5%）；处理四、五、六为冷喷包被酸组，分别在基础饲粮中添加1.0%、1.5%和2.0%的冷喷包被酸（含量≥40%）。ETEC菌株购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，血清型为O:K91:K88ac。攻毒前，各处理组小鼠连续采食相应饲粮14天，第15天采用ETEC菌液攻毒，建立腹泻模型，攻毒途径为腹腔注射。攻毒后，各处理组小鼠继续饲喂各自试验饲粮7天。试验设计见表1。
表1试验设计
试验结果：
1.冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠体重的影响
表2冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠体重的影响
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），相同或无字母表示差异不显著（P＞0.05）。下表同。
由表2可见，攻毒前，连续饲喂试验饲粮14d后，各处理组小鼠的平均日增重和平均日采食量无显著差异（P＞0.05），但从数值上看，中剂量冷喷包被酸组的饲料利用效率最高。攻毒后，ETEC组和低剂量冷喷包被酸组小鼠体重显著低于CON组小鼠（P＜0.05）。
2.冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠器官指数的影响
表3冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠器官指数的影响
由表3可见，攻毒前，连续饲喂试验饲粮14d后，各处理组小鼠器官指数无显著差异（P＞0.05）。攻毒后，与CON组相比，ETEC组小鼠脾脏指数（24h和h）、肾脏指数（24h）显著增加（P＜0.05），冷喷包被酸组小鼠心脏指数和肾脏指数显著增加（24h;P＜0.05），低剂量冷喷包被酸组小鼠肝脏指数显著降低、脾脏指数显著增加（h;P＜0.05）；与ETEC组相比，低剂量冷喷包被酸组小鼠肝脏指数显著降低（h;P＜0.05）。
3.冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠免疫反应的影响
表4冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠血清免疫指标的影响
由表4可见，攻毒前，连续饲喂试验饲粮14d后，各处理组血清炎性因子含量无显著差异（P＞0.05）。攻毒后，与CON组相比，ETEC组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ和D-lactate含量显著增加（24h、h；P＜0.05），DAO活性显著提高（24h；P＜0.05）；与ETEC组相比，低剂量冷喷包被酸组小鼠血清中D-lactate含量和DAO活性显著降低（24h；P＜0.05），中剂量冷喷包被酸组小鼠血清中IL-1β（24h、h）、TNF-α（24h）、INF-γ（24h、h）、D-lactate（24h）和DAO活性（24h）含量降低（P＜0.05），高剂量冷喷包被酸组小鼠血清中TNF-α、INF-γ和D-lactate含量及DAO活性显著降低（24h；P＜0.05）。
4.冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠空肠形态结构的影响
表5冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠空肠形态结构的影响
图1小鼠空肠组织形态图
由表5和图1可见，攻毒前，连续饲喂试验饲粮14d后，各处理组小鼠空肠绒毛排列整齐密集且无显著差异（P＞0.05）。攻毒后，小鼠空肠绒毛稀疏、排列不整，部分脱落，饲粮添加冷喷包被酸能够缓解ETEC感染导致的小鼠肠道绒毛结构损伤。与CON组相比，ETEC组小鼠空肠绒毛高度和VCR（绒毛高度与隐窝深度比值）显著降低（24h、h；P＜0.05）；与ETEC组相比，中剂量冷喷包被酸组小鼠空肠绒毛高度和VCR比值显著增加（24h、h；P＜0.05），高剂量冷喷包被酸组小鼠空肠VCR比值显著增加（h；P＜0.05）。
5.冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠空肠黏膜炎性因子表达的影响
表6冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠空肠黏膜炎症因子mRNA表达的影响
注：TLR，Toll样受体；MyD88，髓样分化因子
由表6可见，攻毒前，连续饲喂试验饲粮14d后，各处理组小鼠空肠黏膜中TLR-2、TLR-4和MyD88mRNA表达水平无显著差异（P＞0.05）。攻毒后，与CON组相比，ETEC组小鼠空肠黏膜中TLR-2、TLR-4和MyD88mRNA表达水平显著提高（24h和h；P＜0.05），低剂量冷喷包被酸可以显著抑制ETEC引起的空肠黏膜MyD88mRNA过表达（24h；P＜0.05），中剂量冷喷包被酸可以显著抑制ETEC引起的TLR-2（24h）和MyD88（24h和h）mRNA过表达（P＜0.05），高剂量冷喷包被酸可以显著抑制MyD88（24h）mRNA过表达（P＜0.05）。
6.冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠空肠黏膜紧密连接蛋白基因表达的影响
表7冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠空肠黏膜紧密连接蛋白基因表达的影响
由表7可见，攻毒前，连续饲喂试验饲粮14d后，与CON组相比，中剂量和高剂量冷喷包被酸组小鼠空肠黏膜OccludinmRNA表达显著上调（P＜0.05），各处理组小鼠空肠黏膜紧密连接相关基因ZO-1和Claudin-1mRNA表达水平无显著差异（P＞0.05）。攻毒后24h，与CON组相比，ETEC组小鼠空肠黏膜中ZO-1、Claudin-1和OccludinmRNA表达水平显著降低（P＜0.05），中剂量冷喷包被酸可以显著缓解ETEC引起的空肠黏膜OccludinmRNA表达下调（24h；P＜0.05）。攻毒后h，与CON组相比，ETEC显著降低了小鼠空肠黏膜中ZO-1和Occludin-1mRNA表达（P＜0.05），与ETEC组相比，中剂量冷喷包被酸提高了ZO-1和Occludin-1mRNA表达（P＜0.05），高剂量冷喷包被酸提高了OccludinmRNA表达（P＜0.05）。
7.冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠结肠微生物区系的影响
7.1多样性分析结果
图2冷喷包被酸对ETEC感染小鼠盲肠微生物多样性的影响（0h）
注：CONG,对照组；ETEC,大肠杆菌攻毒组；BA.L,低剂量包被酸组；BA.M,中剂量包被酸组；BA.H,高剂量包被酸组。下同。
图3冷喷包被酸对ETEC感染小鼠盲肠微生物多样性的影响（24h）
图4冷喷包被酸对ETEC感染小鼠盲肠微生物多样性的影响（h）
基于IIIuminaNova测序平台测序，构建PCR-free文库，然后进行双末端（Paired-End）测序。AlphaDiversity用于分析样本内的微生物群落多样性，通过Alpha多样性可以反映样本内的微生物群落的丰富度和多样性。对不同样本在97%一致性阈值下的Alpha多样性分析指数进行统计。由图2（A和B）可知，攻毒前，中剂量冷喷包被酸组小肠盲肠微生物丰富度（observed_species和chao1）显著高于对照组（P＜0.05），高剂量冷喷包被酸显著降低了小鼠盲肠微生物simpson指数和shannon指数（P＜0.05）。由图3（A-D）可知，攻毒后24h，各处理组小鼠盲肠微生物丰富度指数和多样性指数均无显著差异（P＞0.05）。由、图4（A-D）可知，攻毒后h，与对照组相比，ETEC组的simpson指数和shannon指数显著降低（P＜0.05），与ETEC组相比，低剂量和中剂量冷喷包被酸组的observed_species指数显著提高（P＜0.05）。
BetaDiversity用于比较样本在组间物种多样性方面存在的差异。由图2-E可知，NMDS结果显示，攻毒前，连续饲喂试验饲粮14天后，对照组聚类最好，且和不同剂量冷喷包被酸组明显区分开，说明冷喷包被酸组和对照组的微生物组成结构差异较大，相似性不高。由图3-E可知，攻毒后24h，对照组聚类最好，但不同剂量冷喷包被酸组和ETEC组微生物群落相对丰度的聚类无法明显区分开。由图4-E可知，攻毒后h，不同剂量冷喷包被酸组与ETEC组区分较为明显，菌群结构组成有较大差异，但对照组和ETEC组无法明显区分开。
7.2物种组成和差异性分析
图5冷喷包被酸对ETEC感染小鼠盲肠微生物组成的影响（0h）
图6冷喷包被酸对ETEC感染小鼠盲肠微生物组成的影响（24h）
图7冷喷包被酸对ETEC感染小鼠盲肠微生物组成的影响（h）
由图5（A-B）可知，攻毒前连续饲喂试验日粮14d后，小鼠盲肠微生物优势菌门为拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes），优势菌属为粪杆菌属（Faecalibaculum）和艾克曼菌属（Akkermansia）。LEfSe分析表明（图5-C和D）各处理组间显著差异的菌群包括：低剂量冷喷包被酸组Muribaculaceae和毛螺菌科（Lachnospiraceae）相对丰度显著提高（P＜0.05），中剂量冷喷包被酸组lleibacterium_valens菌属相对丰度显著提高（P＜0.05）。由图6（A-B）可知，攻毒后24h，小鼠盲肠微生物中拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmucutes）为优势菌门，粪杆菌属（Faecalibaculum）和艾克曼菌属（Akkermansia）为优势菌属。LEfSe分析表明（图6-C和D）各组间差异显著的菌群包括：与对照组相比，ETEC组Erysipelatoclostridiaceae菌科，丹毒荚膜菌属（Erysipelatoclostridium）丰度显著提高（P＜0.05）。中剂量冷喷包被酸组丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）和Eubacterium_ruminantium菌属占优势。由图7（A-B）可知，攻毒h后，小鼠盲肠微生物中厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）为优势菌门，粪杆菌属（Faecalibaculum）、假单胞菌属（Pseudomonas）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）为优势菌属。LEfSe分析表明（图7-C和D）各处理组间差异显著的菌群包括：中剂量冷喷包被酸组小鼠盲肠微生物中丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）和粪杆菌属（Faecalibaculum）相对丰度显著提高（P＜0.05），高剂量冷喷包被酸组小鼠盲肠微生物中Muribaculaceae菌科占显著优势。
7.3PICRUSt基因功能预测
图8PICRUSt基因功能预测聚类热图（0h）
图9PICRUSt基因功能预测聚类热图（24h）
图10PICRUSt基因功能预测聚类热图（h）
PICRUSt是一种根据Marker基因进行元基因组功能预测的生物信息软件包，可以根据16S测序数据进行基于KEGG数据库的功能预测。由图8可知，攻毒前连续饲喂试验日粮14d后，冷喷包被酸组的多种基础代谢通路丰度增加，其中，低剂量冷喷包被酸组主要集中在氨基酸代谢（Amino_Acid_Metabolism）、多糖合成与代谢（Glycan_Biosynthesis_and_Metabolism）和精氨酸和脯氨酸代谢（Arginine_and_Proline_Metabolism）等通路，中剂量冷喷包被酸组主要集中在异性生物质降解和代谢（Xenobiotics_Biodegradation_and_Metabolism）膜转运（Membrane_Transport）等通路，高剂量冷喷包被酸组主要集中在免疫系统（ImmuneSystem）、代谢（Metabolism）和分泌系统（Secretion_System）等代谢通路。由图9可知，攻毒后24h，ETEC组在膜运输（Membrane_Transport）、环境适应（Environmental_Adaptation）和运输（Transporters）等相关通路丰度降低，在氧化磷酸化（Oxidative_phosphorylation）和能量代谢（EnergyMetabolism）等通路丰度增加。中剂量冷喷包被酸在提高免疫系统（Immune_System）、果糖和甘露糖代谢（Fructose_and_Mannose_Metabolism）和半胱氨酸与蛋氨酸代谢（Cysteine_and_Methionine_Metabolism）等通路中发挥着重要作用，而高剂量冷喷包被酸对提高脂质代谢（Lipid_Metabolism）和信号传导（Signal_Transduction）等代谢通路有积极作用。由图10可知，攻毒h后，ETEC组在免疫系统（Immune_System）、能量代谢（Energy_Metabolism）、核苷酸代谢（Nucleotide_Metabolism）、细胞复制与修复（Replication_and_Repair）和糖酵解/糖异生（Glycolysis/Gluconeogenesis）等相关代谢通路丰度降低，冷喷包被酸对多种基础代谢通路丰度有积极调控作用，尤其是中、高剂量冷喷包被酸的调控作用明显。
8.冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠盲肠内容物挥发性脂肪酸的影响
表8冷喷包被酸对大肠杆菌攻毒小鼠盲肠挥发性脂肪酸含量的影响
肠道微生物分解和代谢产生的代谢物是肠道微生物发挥不同生理调控功能的主要作用媒介，如短链脂肪酸、多不饱和脂肪酸等。从表8可知，攻毒前，连续饲喂试验日粮14d后，中剂量冷喷包被酸组小鼠盲肠食糜短链脂肪酸含量在数值上最高，但差异不显著（P＞0.05）。攻毒后24h，与CON组相比，ETEC组小鼠盲肠食糜中乙酸含量显著降低（P＜0.05），与ETEC组相比，中剂量冷喷包被酸组小鼠盲肠食糜乙酸和丁酸含量显著提高（P＜0.05），高剂量冷喷包被酸组乙酸含量显著提高（P＜0.05）。攻毒后h，与CON组相比，中剂量和高剂量冷喷包被酸显著抑制了ETEC感染导致的小鼠盲肠食糜丁酸含量降低（P＜0.05）。
试验结论：
本试验条件下，相较于纯苯甲酸日粮，添加冷喷包被苯甲酸可改善ETEC感染小鼠的免疫机能和肠道功能，其作用机理可能与冷喷包被后苯甲酸显著调控肠道微生物区系平衡有关。
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广东酸能生物科技有限公司（以下简称“酸能”）是一家酸制剂全球服务商。
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