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巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）属于β-疱疹病毒，有严格的宿主特异性，已经与其哺乳动物宿主共进化数百万年。人源CMV通常在新生儿出生数月内感染人。CMV通过肠道或消化道感染宿主，并建立起终生持续感染，可在溶原和复制阶段间切换。CMV是具有囊膜的双链DNA病毒，基因组约kb，编码多种基因，部分基因产物可用于劫持NF-κB、IRF-及STAT-依赖的信号途径。通常认为鼠源MCMV的致病过程与人源HCMV十分类似，因而MCMV常用于研究CMV的生物学过程。
巨噬细胞（macrophage）是屏障系统中最常出现的免疫细胞类型，因组织特异性的转录因子和环境信号（如肺部的PPAR-gandGM-CSF）不同而产生不同的表型。在组织中，巨噬细胞适应神经和血管等显微结构。组织驻留巨噬细胞的分化方向通常是单一的，但其可塑性依然保留，以应对宿主和环境界面上的变化。这种可塑性通常限制在维持稳态和炎症急性状态下，并被限定在巨噬细胞适应性位点的有限范围内。在稳态下，巨噬细胞吞噬凋亡细胞并分泌具有免疫调节作用的细胞因子（如IL-10）以维持耐受状态。在病原体入侵过程中，巨噬细胞也是最早响应的免疫细胞，它们吞噬病原菌并促进中性粒细胞、单核细胞及其他免疫细胞的招募。
那么CMV在入侵宿主阶段是如何建立起初始感染的呢？年6月10日，德国弗莱堡大学免疫缺陷研究所的PhilippHenneke教授课题组在Cell杂志发表题为Cytomegalovirussubvertsmacrophageidentity的研究长文，揭示巨噬细胞病毒CMV感染可以诱导不同组织（肺部和结肠）中完全分化的巨噬细胞转化免疫表型和细胞功能，病毒感染的骨髓来源巨噬细胞在转录水平和蛋白水平均表现出干性（stemness），迁移能力和可感染性增强。更进一步发现，CMV可以利用骨髓来源的巨噬细胞的细胞周期机器进行自身DNA的复制，该过程类似上皮向间充质转变（EMT）过程，包括转录因子ZEB1和SNAI2的上调。经呼吸道感染小鼠时，CMV首先靶向肺泡巨噬细胞，被感染的巨噬细胞产生类型转换，而（未被感染的）旁观者巨噬细胞正常激活抗病毒反应。肺泡巨噬细胞种类限定信号通路的转换促进病毒传播，并增加小鼠对后继细菌感染的易感性。
具体研究结果如下：
1、CMV感染的巨噬细胞在表型上区别于旁观者巨噬细胞
为区分病毒感染与否，作者首先构建一株表达GFP的MCMV毒株。在体外，鼠胚成纤维细胞（MEF）感染病毒可见GFP表达，证明病毒可以复制；经腹腔注射感染小鼠14天后，MCMV-GFP在唾液腺中达到最高滴度，说明报告基因的插入未改变病毒的毒力和扩散能力。接着用流式细胞术和荧光显微镜分析了MCMV感染的骨髓来源巨噬细胞，在感染两天后的样品中发现两群细胞，相较于未感染的旁观者巨噬细胞，被病毒感染且表达GFP的细胞群表面积变小，圆度增大。而且，骨髓来源的巨噬细胞初始状态是同源的，加入集落刺激因子（M-CSF）后发生分化，但组织驻留的单核细胞则不分化。此外，MCMV-GFP感染的巨噬细胞还包括肠道巨噬细胞和小胶质细胞。
使用低感染剂量时，GFP+的骨髓来源巨噬细胞在感染48小时后达到平台期，这与β-疱疹病毒的缓慢复制特征相吻合。感染10天内，几乎所有骨髓来源的巨噬细胞都被感染。使用病毒DNA聚合酶抑制剂Fosarnet可阻止CMV感染骨髓来源的巨噬细胞。需要注意的是，被感染的骨髓来源巨噬细胞的出现是剂量依赖的，在高感染复数（MOI）下可诱导出现均质的GFP+巨噬细胞类群。此前曾有报道，I型干扰素可以介导对CMV感染的抗性，本研究发现I型IFN受体缺失型（Ifnar-/-）小鼠与野生型小鼠中骨髓来源巨噬细胞在初始感染性上无差别，但前者的旁观者巨噬细胞更易感。这表明CMV的初始感染是一个随机过程，其中骨髓来源的旁观者巨噬细胞在IFN-I的保护下可以短暂地获得对病毒的抗性。作者将旁观者巨噬细胞进行分选后继续培养24小时至6天，GFP信号始终未检测出，从而确诊这些细胞未被病毒感染。
2、CMV感染改变巨噬细胞的表型和功能
CMV感染后，巨噬细胞表现出形态上的改变，暗示其细胞表面表达的分子发生变化。于是作者对其进行免疫表型分析，发现在感染24小时后，CD45、F4/80、CD11b、CD64的表达均发生下调。更重要的是，胞内CD11b的表达完全消失。感染3天后，骨髓来源的巨噬细胞就无法再用表型marker区分开，这种变化不依赖MyD88和STING信号通路，也不是由于GFP的表达。为确证这类新出现的细胞确实是巨噬细胞，研究者通过给Cx3cr1creERROSA26-Tomatoflox小鼠注射羟基三苯氧胺（OH-TAM）对骨髓来源巨噬细胞进行组成型标记，用以区分不同种类的巨噬细胞，发现两种被感染的巨噬细胞的表型均发生变化，表面分子的表达均出现下调。而且MCMV的感染很大程度上影响了组织驻留巨噬细胞的特征免疫表型：结肠和腹膜处的巨噬细胞中，CD11b、F4/80、CD45均发生下调，肺泡巨噬细胞缺失CD11c和SiglecF的表达，小胶质细胞下调了CD11b、MerTK、CD64的表达。透射电镜分析表明，细胞在病毒颗粒附近的膜突出和伪足缺失，细胞圆度增加，线粒体数目升高，最大细胞呼吸率也相应升高。上述表面分子的改变提示CMV感染也影响巨噬细胞的关键吞噬功能（phagocytosis）。实验证实，尽管内吞能力（endocytosis）依然存在，但MCMV感染后巨噬细胞完全丧失对颗粒物的吞噬能力；LPS诱导的细胞因子释放，如TNF和IL-10，也被破坏。因而，CMV的感染与巨噬细胞能力显著丧失相关。
3、CMV诱发巨噬细胞出现干细胞样特征
为进一步剖析这一转换过程，研究者对病毒感染3天后的骨髓来源巨噬细胞进行了RNA测序，此时细胞表面marker下调达到峰值，而未感染细胞中则未检出病毒基因的转录，因此可以比较相同细胞环境下病毒感染的影响。PCA分析发现有-个基因上调，GO分析发现“巨噬细胞”相关基因发生下调，更重要的是，与巨噬细胞谱系定型和分化相关的核心转录因子，如Spi1、Cebpa、Cebpb、Irf8表达显著下降，这与细胞形态缺失相印证。GO分析还显示，旁观者巨噬细胞主要表达IFN-I激活和病毒防御相关基因，而被感染的巨噬细胞则表达与组织发育和形态发生相关基因，尤其是注释为“干细胞种群保持”相关基因的表达显著上调。此前在组织驻留巨噬细胞中的研究发现，其自我更新与干性诱导因子Klf4和Myc的上调及分化因子Mafb和Maf的抑制有关；而本研究的测序结果显示CMV降低了后两者的表达，却上调了Klf4的表达。而且在造血母细胞中典型表达的Kit、Flt3、Bmi1也上调，这些都表明干细胞样表型的出现。
此前曾有报道指出，其他疱疹病毒可以通过转录后机制调节宿主蛋白表达，于是作者又进行时间分辨的蛋白质谱分析，发现CMV感染后两种巨噬细胞的蛋白组差异持续增加，被感染类群的表面marker持续减少。GO分析显示“I型干扰素调节”和“病毒响应”相关蛋白在旁观者类群中上调，而被感染巨噬细胞中有丝分裂细胞周期、胚胎发育、干细胞类群维持、端粒维持相关条目被富集；感染三天后，端粒组分相关基因的表达增加。综上，CMV感染三天后蛋白质组数据显示出与转录组数据高度相关。因此，CMV的感染使巨噬细胞在转录和翻译水平上均出现由类群特异性向干性方向转变。
4、CMV感染的巨噬细胞失去抗原递呈能力，转而将细胞周期机器供予病毒复制
在组织和淋巴节中，除了树突状细胞，巨噬细胞也可作为抗原递呈细胞并表达共刺激蛋白，用以激活淋巴细胞应对病毒感染。与干扰素激活蛋白（如RSAD2、OASL1、ISG15）的上调相一致，旁观者巨噬细胞中表达共刺激受体CD40、与淋巴细胞互作相关蛋白、MHCI型分子锚定蛋白；而被感染的细胞则未能加工卵清蛋白用于刺激T细胞增殖，但抗原肽直接递呈给CD8+T细胞的能力是保留的，说明CMV感染的骨髓来源巨噬细胞失去加工抗原蛋白的能力，但维持MHCI型分子的表达，转录组和蛋白质组的数据也显示其抗原递呈机器的缺失。与此相对应，旁观者巨噬细胞中多肽驻留相关蛋白，如TAP1、TAP2、TAPBP、TAPBPL都上调，说明具备抗原递呈能力。
接着，时间分辨质谱显示：在感染早期，骨髓来源巨噬细胞的细胞活性、受体互作、肌动蛋白细胞骨架重构相关的蛋白过表达，说明细胞发生应激反应。但感染2-3天后，与线粒体加工、氧化还原信号相关蛋白表达升高，显示出代谢的变化；而且自感染后2天持续至6天，染色质加工、DNA依赖的转录调节、减数分裂、细胞周期相关蛋白高表达。但被感染的巨噬细胞未表现出前体细胞的集落形成能力，尽管细胞周期相关蛋白的表达量持续升高。此前曾报道其它疱疹病毒可以打乱成纤维细胞的细胞周期，使其驻留在G1/S期。巨噬细胞中的情况如何呢？作者通过分析细胞周期相关蛋白，发现被感染的巨噬细胞出现更多的Ki67响应，说明细胞周期被激活。肿瘤抑制蛋白RB1和同家族的RBL1/2是典型的细胞周期调节蛋白，它们的磷酸化使得转录因子E2F解离，导致S期进展。实验中也的确检测到RB蛋白的磷酸化，及E2F靶标基因的转录增加，从而说明被感染细胞跨过G1/S期间的驻留期，开启S期早期的DNA合成，当然也可能是为MCMV提供复制相关的机器。为此，作者利用溴脱氧尿嘧啶（BrdU）刺激感染和未感染细胞，发现未感染细胞中进行的是细胞周期中的真核DNA复制，而被感染细胞中复制的是CMV的病毒DNA，且蛋白表达动力学显示病毒进入裂解周期。此外，被感染巨噬细胞中出现A-型和B-型核纤层蛋白的表达和磷酸化，说明核膜和染色质结构在重构，这与病毒出核特征是吻合的。概括起来，CMV导致被感染巨噬细胞出现干细胞样状态，是为了利用其胞内机器促进病毒DNA的复制从而产生子代病毒。
5、CMV利用Wnt信号通路诱导细胞转换并增加其迁移能力和易感性
对转录组和蛋白质组数据进行通路分析，发现粘附相关、Wnt、TGF-β和Notch信号通路多次出现，这些通路的调整曾出现在表皮细胞的EMT过程中，该过程通常发生在胚胎发育、肿瘤转移。GO分析中有关间充质化转移及其调节、EMT相关条目在转录组数据中多次出现。此外，转录因子Twist1、Snai2、Zeb1、Cdh2、Fn1在被感染巨噬细胞中也多次出现，上述分子相互协调促成胚胎发育和肿瘤演进过程中的细胞重编程过程，涉及干性、形态和功能上的变化，并与迁移性和易感性的增强相关。为研究这些特征，作者使用时差显微镜进行观察，发现被感染的巨噬细胞迁移距离更远，速度更快，而且它们与其他细胞相互作用，呈现一种改变的阿米巴虫样迁移方式，并形成水泡（bleb）。此外，在迁移实验中，仅被感染的巨噬细胞可以在细胞外基质中迁移。进一步的实验证实，这种迁移能力的变化促进了病毒的扩散。此外，中和抗体无法阻止胞内CMV的扩散，说明CMV的扩散是通过感染性细胞与未感染细胞直接接触完成的。
进一步将蛋白质组数据对比数据库，构建出被感染巨噬细胞中的蛋白互作网络，发现与TGF-β和Wnt信号通路相关。而其中，Wnt的靶基因和蛋白在被感染细胞中上调表达，尤其是整合素β3(Itgb3/CD61)高表达，并可被流式染色确认，因此CD61被确认为转换过程中的内源性报告基因。
Wnt的激活分为经典和非经典两种方式，非经典的平面细胞极性通路调节细胞骨架，进而通过下调Rho/Rho激酶（ROCK）通路影响细胞形态。而ROCK通路又与细胞收缩和水泡形成有关。作者发现使用ROCK抑制剂时，被感染细胞体积更大并失去圆度。进一步分析蛋白相互作用网络发现，经典Wnt通路中的β-catenin、p、CBP位于相互作用网络的中心节点，与其他蛋白存在大量相互作用（图5G\L）。当阻断这些相互作用时，部分恢复了被感染巨噬细胞中CD11b的表达并阻止了CD61的上调。但对TGF-β通路的阻断则未能逆转被感染巨噬细胞的转变。文献报道β-Catenin通过转录因子LEF/TCF激活Zeb1启动子，进而诱发病原菌侵染。作者通过分析LysMcre/+:Zeb1flox/flox小鼠中骨髓来源的巨噬细胞，发现Zeb1缺失的巨噬细胞在感染CMV时进入基质胶的数目较野生型明显减少，但间质标记物和基质金属蛋白酶2（Mmp2）的表达只是略微下降，Zeb2的表达未受到影响。而人源单核细胞来源的巨噬细胞在感染人源HCMV时也同样上调AXIN2、SOX9、ZEB1、SNAI2、CDH2的转录。因此，作者证实CMV通过影响Wnt通路增加骨髓来源巨噬细胞的迁移能力和易感性，这种转化是部分通过Zeb1介导的。
6、小鼠体内被感染的肺泡巨噬细胞发生重编程
最后，作者探索被CMV感染的小鼠体内的肺泡巨噬细胞是否发生重编程。作者首先证明经呼吸道感染时，CMV首要靶向肺泡巨噬细胞。MCMV感染的肺泡巨噬细胞中CD11c、SiglecF、CD64的表达下调。感染3天后肺泡巨噬细胞的转录组测序结果与骨髓来源巨噬细胞被感染时的表达谱显示强相关性。接着作者确认Wnt靶基因、N-cadherin及Snai2、Zeb1为关键效应分子，基因集合富集分析确认Wnt通路及EMT相关基因与感染过程相关。最后确认CMV感染的肺泡巨噬细胞可以通过Itgb3/CD61作为免疫表型的marker。因此，在呼吸道感染过程中，MCMV主要通过靶向肺泡巨噬细胞，并通过下调表面标志物、增加间质标志物、激活转录因子Snai2和Zeb1对其进行扰动。
7、肺泡巨噬细胞促进病毒在细胞间扩散并入侵肺间质
组织中的巨噬细胞与其所在的微环境彼此影响，因此，作者评估了MCMV感染过程中肺泡巨噬细胞的群体动力学，发现新感染细胞中的病毒来自于已感染的细胞，即肺泡巨噬细胞可以向其他细胞直接传播病毒。接着，作者发现相较于未感染细胞，被感染的肺泡巨噬细胞更不易被表面marker的抗体标记，说明一部分被感染细胞已入侵肺组织。为确认这一现象，作者将Itgaxcre/+ROSA26-Tomatoflox小鼠中的肺泡巨噬细胞分选出移植到不产生内源性肺泡巨噬细胞的Csf2rb-/-小鼠中，移植8周后进行MCMV的感染，肺部组织染色发现在感染一天后，表达GFP+Tomato+的肺泡巨噬细胞即已出现在肺间质中。此外，在小鼠纵膈引流淋巴节中也发现GFP+细胞，再次借助移植实验，确认其感染也源于被感染的肺泡巨噬细胞。因此，一小部分被感染的肺泡巨噬细胞可以迁移至不同部位。
接下来，作者评估ZEB1在肺泡巨噬细胞在体迁移中的作用，发现ZEB1缺失并不能有效改变被感染细胞数目。在移植小鼠体内，感染初期仅肺泡巨噬细胞可被MCMV感染，而中性粒细胞和单核细胞均未被感染。RNA-seq结果显示LysMcre/+小鼠与LysMcre/+:Zeb1flox/flox小鼠中被感染的肺泡巨噬细胞的基因表达谱不同，GO分析中前者多次出现与细胞迁移、免疫反应、氧化物响应和细胞对IFN-β响应相关的条目。因此，MCMV感染的肺泡巨噬细胞以ZEB1依赖的方式入侵肺间质（部分情况下可达纵膈引流淋巴节），促进病毒在肺部及其他组织中的扩散。
8、CMV感染影响肺泡巨噬细胞功能并使其易于被二次感染
肺泡巨噬细胞的一大标志性功能是对不断产生的表面活性剂的吞噬清除。为检测其吞噬能力的变化，作者在小鼠感染病毒2天后通过气管给予荧光染料PKH26-PCL，发现肺支气管灌洗液和肺组织匀浆中被感染的肺泡巨噬细胞吸收染料的能力显著下降，灌洗液中表面活性剂组分发生积累。
接下来，作者又研究了CMV感染肺泡巨噬细胞的后续功能性影响及对其他病原体感染的影响。先使用poly(I:C)模拟RNA病毒感染，在CMV感染后3天通过气管添加，8小时后分析分选出的肺泡巨噬细胞，发现被感染的巨噬细胞未能产生NF-κB或IFN相关的细胞因子。然后又测试军团菌（Legionellapneumophila）感染小鼠的情形，该菌常通过生活环境（如医院内）感染可导致严重肺炎，同样靶向肺泡巨噬细胞。作者发现当半数肺泡巨噬细胞感染CMV时，会严重影响其抗细菌反应，因为此时已无法清除细菌在肺部的定植，小鼠体重持续降低；而当小鼠只感染军团菌时，在感染后三天即已康复。而且，先后感染CMV和军团菌的小鼠肺部中负责清除细菌感染的中性粒细胞数目明显减少；而外周血中的中性粒细胞在二次感染早期就已升高，提示CMV对肺泡巨噬细胞的感染影响其趋化因子的产生。于是，作者分选出肺泡巨噬细胞，使用表达dsRed的军团菌菌株进行感染，这样就可以通过不同荧光区分CMV和军团菌感染，发现CMV感染的肺泡巨噬细胞不能吞噬军团菌，这与此前验证的肺泡巨噬细胞吞噬能力受影响是一致的。而且，已感染CMV的肺泡巨噬细胞再次感染军团菌的急性期，细胞因子和中性粒细胞趋化剂Cxcl1和Cxcl2严重减少。所以，CMV特异性地靶向肺泡巨噬细胞，改变其生理功能，并影响其对二次感染的应对。
总得来说，本文通过严谨的标记对照细胞实验，结合大规模的动态的转录组和蛋白质组数据，揭示出CMV感染过程中巨噬细胞表面标志物的变化并非仅仅为了阻止受体-配体相互作用，而是由于发生细胞重编程，该过程主要涉及Wnt信号通路和转录因子ZEB1。CMV经呼吸道入侵时，首要靶向肺泡巨噬细胞，且一部分的被感染的肺泡巨噬细胞会向肺间质迁移，通过细胞间直接接触将病毒传播至未感染细胞。本文的发现对完整理解巨噬细胞的生物学功能、CMV感染过程及其相关疾病的发生都有重要的启示作用。
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