新生儿感染是儿科医生面临的重大挑战，新生儿免疫系统不成熟，易感因素多，在接触病原体时防御功能较为脆弱，导致相对高的发病率和病死率。由于新生儿感染的临床表现往往不典型，病情较为隐匿、进展迅速，快速明确病原体对疾病的诊治及转归十分重要。
mNGS具有无偏倚性、覆盖广、敏感性高，用时相对较短等优点，尤其在混合感染或病*感染方面展现其优势，在新生儿感染性疾病中具有广阔的应用前景。
为提高mNGS的诊断质量，规范其在新生儿感染性疾病领域的临床应用，制定了《宏基因组二代测序技术在新生儿感染性疾病中的临床应用专家共识》。
01
mNGS在NICU感染性疾病中的应用
共识1患儿具有急危重症表现，不除外感染，或有继发或并发危及生命的严重感染，需要尽快明确病原体，建议常规检测的同时送检mNGS。
急危重症指多器官功能衰竭，由新生儿败血症、脑膜炎、重症肺炎、腹腔感染等引起者应及时明确致病微生物，但由于其致病微生物复杂，常规方法易遗漏部分病原微生物，因此建议常规检测的同时送检mNGS。多项研究表明mNGS对败血症的检测灵敏度远远高于传统培养。共识2高度怀疑患儿存在新生儿血流感染甚至败血症时，若经验治疗3d效果不佳且常规微生物学检查送检阴性，建议调整经验抗微生物治疗方案同时采集血液样本送检mNGS。推荐DNA测序作为血流感染的首选检测方法，在高度怀疑RNA病*感染的情况下可同时进行RNA测序。共识3对于疑似中枢神经系统感染的患儿，条件允许的情况下建议留取常规、生化及微生物检查所需脑脊液的同时留取mNGS所需脑脊液，若脑脊液检查结果提示常规或生化指标异常且常规微生物检测阴性且经验性抗感染治疗3d无效，建议立即送检mNGS。考虑到脑脊液常规微生物检查的阳性率较其他类型样本低且脑脊液样本所含人核酸含量较低，因此脑脊液较适合开展mNGS检测。在测序方法的选择上，若临床排除病*感染的可能，优先进行DNA测序。当脑脊液常规、生化无明显异常且脑脊液微生物学检查阴性，临床上仍高度怀疑CNS感染，或临床表现复杂、无特定怀疑方向送检mNGS时，推荐对脑脊液样本中的DNA和RNA同时进行测序。共识4对于疑似呼吸道感染的重症患儿，常规微生物检查阴性且治疗3d无效，可送检mNGS，应同时进行DNA及RNA测序。样本类型优先选择肺泡灌洗液，其次考虑气管插管下获得痰液及鼻咽拭子样本。mNGS可对包括呼吸道定植菌群和引起感染的病原菌同时进行检测，同时对于多重感染的鉴定具有极大优势。共识5疑似新发病原体、临床上提示可能有一定的传染性，或者疑似特殊病原体或罕见病原感染，常规微生物检测方法阴性，建议尽快完善mNGS。mNGS检测无需提前设定目标病原体，其直接对样本中所有核酸进行测序，具有检测新发病原和罕见病原的能力。新发病原体指引起人群中出现某种新的临床表型的病原，或过去存在但其引起的发病率或地理分布明显增加的病原。但对于新发病原，由于缺乏参考基因组，完整的鉴定种属以及和已知种属的进化关系，需要较高的测序序列数，建议优先采集病灶标本或进行富集。共识6疑似存在混合感染，常规微生物检查结果不能解释临床表现的全貌或抗感染治疗的反应，经验性治疗3d无效时，建议进一步完善常规检测的基础上，开展mNGS。相比于常规方法有限的检测范围，mNGS的原理使得其具有更广泛的检测范围，理论上可以检测任意病原微生物。这一特点使得其更易检出混合感染。共识7出现某种感染性疾病的聚集性发病或者疑似院内感染暴发，在常规快速检测不能明确病原时，建议开展mNGS。共识8疑似局部感染，如眼部（角膜炎或溃疡、眼内炎、急性视网膜坏死等）、鼻部、耳部或局部蜂窝织炎等，在常规微生物检测未能明确病原情况下，可开展mNGS。共识9由于各种原因导致的胸腔积液及腹腔积液，在送检常规生化及培养的同时留取胸、腹腔积液样本，若常规、培养阴性或经验性抗感染治疗3d无效，仍怀疑感染所致者，建议立即送检mNGS。共识10对于mNGS检测阴性但临床高度怀疑感染的患儿，必要时再次取样复mNGS。共识11对常规微生物学检查容易明确病原体且经验治疗通常有效的感染，不建议常规进行mNGS检测，不建议应用mNGS评估抗感染治疗效果。
图1新生儿重症监护病房感染性疾病患儿送检宏基因组二代测序流程
02
标本采集和转运
共识12各类型样本采集需要无菌操作，血液、高凝状态的胸腔积液、腹腔积液、脑脊液样本，采集后需上下颠倒混匀5~10次。
非血液标本采集通常采用带螺旋盖的无菌冻存管，但预期可能凝集的标本及血液样本需采用专用采血管。所有样本采集完成后，均需要封口膜密封，条码标记。
共识13推荐直接从患儿感染部位的体液或组织中采集样本。
共识14患儿存在感染表现但病情危重或不能耐受有创操作时，可考虑采集患儿的血液标本进行常规微生物方法检测的同时送检mNGS。
原则上，送检感染部位的体液或者组织标本灵敏度、特异度和可信度更高。有创操作不耐受时，可送检血液标本，但可能会降低检测结果的准确性。
03
报告解读
共识15解读mNGS检测报告应参考检测方法的数据和检出病原序列数量、基因组覆盖度、微生物丰度等指标，结合标本采集部位、检出病原的致病特性以及患儿临床资料进行个体化解读。
mNGS由于检出结果丰富，虽然提高了病原微生物检测敏感性，也对正确判读致病微生物造成了困难。尤其是有菌区的样本，由于定植微生物和致病微生物的混杂以及不同微生物基因组大小和核酸提取效率的差异，单纯依靠检出序列数判读并不准确。
阳性的判读通过建立阈值实现，阈值往往包含以上3个指标及内参对照的检出等情况，不同实验室采取的阈值标准往往不同。
在阳性报告中，达到阳性阈值的微生物检测结果即可信，但如果有多种微生物存在，则应结合样本类型考虑定植微生物相关假阳性结果；
在阴性报告中，需判断阴性结果原因，是因为病原体载量未达到阳性阈值标准还是因为确实不存在病原体，需结合患儿具体临床信息。
共识16源于微生物正常定植部位的标本（例如支气管肺泡灌洗液），鉴别检出序列是属于致病微生物、污染物，还是定植菌群较为困难，应综合患儿临床表现及辅助检查综合判断。
建议在出具检测报告时，结合不同标本类型与检出病原微生物的种类进行解读，